يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

مقدمة لالدبابير الطفيلية من

18.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/3347

⸱

مايو 7, 2012

 ,  ,  , 
1Biology Department, The City College of New York, CUNY, 2The Graduate Center, The City University of New York

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

الطفيل (الطفيلية) الدبابير تشكل فئة كبيرة من الأعداء الطبيعيين للحشرات كثيرة منها ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا. سوف نقدم التقنيات لنشر هذه الطفيليات في ذبابة الفاكهة النيابة. وشرح كيفية تحليل آثارها على الأنسجة المناعية لل ذبابة الفاكهة اليرقات.

الملخص

تهاجم معظم أنواع الدبابير الطفيلية المعروفة المراحل اليرقية أو الخادرة من ذبابة Drosophila. وبينما تصيب Trichopria drosophilae المراحل الخادرة للعائل (الشكل 1A-C)، تهاجم إناث جنس Leptopilina (الشكل 1D, 1F, 1G) وجنس Ganaspis (الشكل 1E) المراحل اليرقية. ونحن نستخدم هذه الطفيليات لدراسة الأساس الجزيئي لسباق تسلح بيولوجي. وتمتلك الدبابير الطفيلية قيمة هائلة كعوامل مكافحة حيوية؛ إذ يحمل معظمها عوامل ضراوة وعوامل أخرى تعدل من فسيولوجيا العائل ومناعته. ويوفر تحليل دبابير Drosophila رؤى حول كيفية تشكيل التفاعلات النوعية بين الأنواع للبنى الجينية للمجتمعات الطبيعية. كما تعمل هذه الدراسات كنموذج لفهم الفسيولوجيا المناعية للعوائل وكيفية إحباط التفاعلات المناعية المنسقة بواسطة هذه الفئة من الطفيليات.

تعمل القشيرة في مرحلتي اليرقة والعذراء كخط دفاع أول. ويعد آلة وضع البيض في الدبور هيكلاً حاداً يشبه الإبرة يقوم بإيصال البيض بكفاءة إلى الجوف الدموي للعائل. تتبع عملية وضع البيض تفاعلات التئام الجروح عند القشيرة (Fig. 1C، رؤوس السهام). تستطيع بعض الدبابير إدخال بيضتين أو أكثر في العائل نفسه، رغم أن بيضة واحدة فقط هي التي تنجح في النمو. أما البيض الزائد أو اليرقات النامية فيتم التخلص منها عبر عملية غير مفهومة بعد. ولذلك يشار إلى هذه الدبابير باسم الطفيليات المنعزلة.

اعتماداً على سلالة الذبابة ونوع الدبور، يواجه بيض الدبور أحد مصيرين؛ فإما أن يتم تغليفه، مما يؤدي إلى وقف نموه (تخرج الذبابة المضيفة؛ الشكل 2، يساراً)؛ أو يفقس بيض الدبور، وينمو، وينسلخ، حتى يتحول إلى حشرة بالغة (يخرج الدبور؛ الشكل 2، يميناً). وتعد L. heterotoma واحدة من أكثر أنواع الدبابير الطفيلية التي تصيب Drosophila دراسةً، وهي "عامة التغذية"، مما يعني قدرتها على استخدام معظم أنواع Drosophila كمضيفات1. وتعتبر L. heterotoma و L. victoriae نوعين شقيقين، ويقومان بإنتاج جسيمات شبيهة بالفيروسات تتدخل بنشاط في استجابة التغليف2. وبخلاف L. heterotoma، فإن L. boulardi طفيلي متخصص، ونطاق أنواع Drosophila التي يستخدمها محدود نسبياً1. كما تنتج سلالات L. boulardi جسيمات شبيهة بالفيروسات3، على الرغم من اختلافها الملحوظ في قدرتها على النجاح في إصابة D. melanogaster1. ويصعب تربية بعض سلالات L. boulardi هذه على D. melanogaster1 لأن الذبابة المضيفة تنجح غالباً في تغليف بيوضها. لذا، من المهم توفر المعرفة بكل من الطرفين في بروتوكولات تجريبية محددة.

بالإضافة إلى الأنسجة الحاجزة (الكيوتيكل، والأمعاء، والقصبات الهوائية)، تمتلك يرقات Drosophila استجابات مناعية خلوية وجهازية وعوامل خلطية تنشأ من وظائف خلايا الدم والجسم الدهني، على التوالي. يؤدي وضع البيض بواسطة L. boulardi إلى تنشيط كلا الذراعين المناعيين1,4. وتوجد خلايا الدم في الدورة الدموية، وفي مجموعات مستقرة تحت الكيوتيكل المقسم، وفي الغدة الليمفاوية. الغدة الليمفاوية هي عضو مكون للدم صغير يقع في الجانب الظهري لليرقة. وتترتب مجموعات من الخلايا المكونة للدم، تسمى الفصوص، بشكل قطعي في أزواج على طول الوعاء الظهري الذي يمتد على طول المحور الأمامي الخلفي للحيوان (الشكل 3A). أما الجسم الدهني فهو عضو كبير متعدد الوظائف (الشكل 3B)، ويقوم بإفراز الببتيدات المضادة للميكروبات استجابةً للإصابات الميكروبية والحيوانية.

تؤدي عدوى الدبور إلى تنشيط إشارات المناعة (الشكل 4)4. وعلى المستوى الخلوي، فإنها تحفز انقسام وتمايز خلايا الدم. وكجزء من الدفاع الذاتي، تتطور تجمعات وكبسولات في الجوف الدموي للحيوانات المصابة (الشكل 5)5,6. تهاجر خلايا الدم المنشطة نحو بيضة الدبور (أو يرقة الدبور) وتبدأ في تكوين كبسولة حولها (الشكل 5A-F). وتتجمع بعض خلايا الدم لتكوين عقد (الشكل 5G-H). ويكشف التحليل الدقيق أن عدوى الدبور تحفز الفصوص الأمامية الأكثر تقدماً من الغدة اللمفاوية على التشتت عند أطرافها (الشكل 6C, D).

نقدم بيانات تمثيلية لمكونات مسار نقل إشارة Toll وهما Dorsal و Spätzle (الأشكال 4، 5، 7)، وهدفه Drosomycin (الشكل 6)، لتوضيح كيفية دراسة تغيرات محددة في الغدة اللمفاوية والجوف الدموي بعد الإصابة بالدبابير. كما تتيح بروتوكولات التشريح الموصوفة هنا استخلاص بيوض الدبابير (أو مراحل نمو الدبابير) من اللمف الدموي للعائل (الشكل 8).

البروتوكول

وينقسم بروتوكول كامل للتجربة في أربع خطوات (الشكل 9). الدبابير التثقيف (1) على يرقات ذبابة، (2) إعداد العدوى وإعداد الحيوانات للتشريح، (3) عزل وتحديد المضيف / الطفيل الهياكل، (4) تحليل الأنسجة المناعية.

1. الزنابير على يرقات ذبابة الفاكهة زراعة

صيانة الثقافات دبور يتطلب تخطيطا دقيقا. نسبة إلى تزايد الذباب، فمن كثيفة العمالة إلى حد ما. نحافظ على المستعمرات دبور لدينا في المختبر على يرقات أو شرانق من سلالة من ذبابة الفاكهة في YW C. ° 24 زراعة الدبابير التي تشمل حفظ مصدر مستمر من المضيفين في مرحلة الحق وتطهير "المصابة" قارورة من الذباب التي تظهر قبل قيام الدبابير. الدبابير اتباع أسلوب haplodiploid من تحديد الجنس وبالتالي فمن المهم أن يتم تزاوج الإناث قبل أن تصيب الجنود.

  1. في يوم 1، إضافة لمسة صغيرة من قبل طازجةقلص عجينة الخميرة (الذي أدلى به خلط 1 مل من الماء في حوالي 1 غرام من الخميرة الجافة النشطة إلى قارورة ذبابة المواد الغذائية الطازجة وصفة من الطعام ذبابة ليست حرجة، ونحن تنمو الذباب على corn-meal/sucrose/agar المتوسطة. مكان 50-60 الشباب (2-4 يوما) YW الكبار (أو غيرها من سلالة النوع البري أساسا) الذباب لتضع بيضها لمدة 48 ساعة في C. ° 24
  2. في اليوم 3، إزالة يطير من قوارير. وضع المكونات الطنانة على القارورة مع قطرة من العسل على الجانب الداخلي من المكونات الطنانة. يتم تخفيف العسل 2:1 في الماء المقطر.
  3. باستخدام CO 2، تخدير الدبابير وفرز 6-8 و 6-8 الإناث الذكور التي ما يقرب من 2-3 أيام من العمر. إضافتها إلى القارورة التي تحتوي على 0-48 ساعة المضيفين القديمة. نلاحظ أن الدبابير هم أكثر حساسية للCO 2 من الذباب، وكنت قد تضطر لمعايرة تعرضهم للغاز. الباحثين ذبابة الفاكهة لا تستخدم ذبابة الفاكهة التخدير القياسية تصميم المحطة. وهناك نقطة انطلاق جيدة لتخدير الدبابير هو لضبط ضغط CO 2لما يقرب من نصف ما هو مطلوب لذباب التخدير.
  4. استبدال المكونات الطنانة (مع العسل) في القارورة. ضع القارورة بلطف على جانبها حتى يستيقظ الدبابير.
  5. وضع هذه القوارير مع يرقات الذباب والدبابير في حاضنة 24 C °.
  6. سوف العدوى ناجحة تأخير pupariation قليلا. المضيفين التي تعرضت لهجوم الدبابير ولكنها قادرة على الدفاع عن نفسها (أو إذا لم يتم المصابين هم)، ومواصلة التنمية بعد الجدول الزمني العادي والذباب الكبار الخروج من هذه puparia قبل وقت كاف من الدبابير.
  7. اعتمادا على الأنواع دبور ودرجة الحرارة، والدبابير eclose في 25-30 يوما.
  8. إزالة الذباب الكبار من قوارير التي الدبابير النامية.

2. إنشاء التهابات وإعداد الحيوانات المصابة بالأمراض الوبائية للتشريح

قبل أن تبدأ، لديك اثنين من الزجاج النظيف أو البلاستيك أطباق بتري، طبق بيركس تشريح مع 9 المنخفضات، Kimwipes، الماء المقطر (في زجاجة بخ)، 70٪ إيثانول (في زجاجة بخ)، 1X PBS (في زجاجة بخ)، والشرائح المجهر، وصغيرة، ملعقة نظيفة في متناول يدي.

  1. لإعداد الإصابات، اتبع الخطوات 1-5 أعلاه. اعتمادا على التجربة، فإنه قد يكون من الضروري استخدام المضيفين التي هي في مرحلة تقريبا نفس التنمية. لهذا، يمكن استخدام egglays من 2-6 ساعات للعدوى.
  2. اليرقات المصابة لحصاد (لتشريح الأنسجة المناعية أو الطفيليات)، وإزالة محتويات قنينة ذبابة في كوب صغير من البلاستيك أو طبق بتري.
  3. باستخدام ملقط وstereomicroscope الجميلة (ملاقط)، واختيار بعناية 6-10 يرقات، واحدة تلو الأخرى ووضعها في الاكتئاب بشكل جيد مع 1X PBS الأولى، ثم نقل منها إلى المياه، والإيثانول 70٪، والمياه، وPBS 1X، على التوالي. الغرض من هذه الخطوات هو تحرير الحيوانات من الطعام وتنظيف شامل الطيران وتعقيم سطحها. وشطف في الماء يخفف الإيثانول وشطف النهائي في PBS يزيل الايثانول. الخطوة 3 أدناه ل، فمن الأفضل عدم تركالحيوانات في برنامج تلفزيوني لمدة أطول من 10 دقيقة.

3. عزل وتحديد المضيف / الطفيل الهياكل

خلفية

الغدة الليمفاوية اليرقات هو جهاز صغير 7 المكونة للدم. الطور اليرقي في الثالث، والغدة الليمفاوية يحتوي على زوج من الفصوص الأمامية الكبيرة التي الجهة الظهرية السفينة (الشكل 3A، 6B-C، 7A-D). وتنقسم كذلك إلى فصوص الأمامية إلى مناطق متخصصة فريدة من نوعها مع خصائص الخلية 7. الأسلاف من أنواع الخلايا الثلاث، plasmatocytes، lamellocytes، وخلايا الكريستال الموجودة في الفص الأمامي. خلايا التامور فصل الفصوص الأمامية من الفص الخلفي أصغر. الغدة الليمفاوية ذبابة الفاكهة هو نموذج لتكون الدم والحشرات الثدييات 8،9.

الدهون في الجسم يشبه وظيفيا للكبد الثدييات. يتم تشغيل استجابة الخلطية في الميكروبية الجسم الدهون أو العدوى التالية دبور 1،4،10. كمانتيجة لذلك، يتم تنشيط مزيجا فريدا من الجينات المضادة للجراثيم الببتيد وتفرز الببتيد في الدملمف 1. الدهون في الجسم هو أيضا الأنسجة الأولية للإنتاج الجليكوجين والدهون الثلاثية وتخزين 11. الدهون في الجسم اليرقات تحتل حجم كبير من hemocoel و، لذلك على عكس الغدة الليمفاوية، فمن السهل تحديد موقع. وسوف نبين الآن كيف لتشريح الغدة الليمفاوية والدهون في الجسم من يرقات الطور الثالث.

قبل أن تبدأ

تحتاج ملقط غرامة (ملاقط) والايثانول تنظيف الشرائح المجهر.

تشريح الغدة الليمفاوية اليرقات

  1. باستخدام ملقط غرامة، حدد تجول اليرقة الطور 3 يوضع في 1X PBS.
  2. وضع اليرقات على شريحة المجهر.
  3. باستخدام ملقط، ضع الحيوان مع الجانب البطنية يصل.
  4. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط، أمسك الحيوان في جانبي نهاية الخلفي (رؤوس سهام 1، الشكل 3A) و (ز)سحب مستديم إهاب لتقديم صغير، والمسيل للدموع سطحية في إهاب.
  5. سوف تحتوي على الدملمف hemocytes، الأمعاء، والدهون في الجسم تبدأ في الهروب من تجويف الجسم. يمكن أن تؤخذ في الدملمف حتى مع "pipetteman" 10 ميكرولتر لجعل مسحات، إذا لزم الأمر.
  6. وضع كل من ملقط على الجانب الأيمن للحيوان تحت السنانير الفم (النصال 2، الشكل 3A)، المسيل للدموع بلطف بشرة.
  7. نقل كل ملقط إلى الجانب الأيسر للحيوان تحت السنانير الفم (النصال 2، الشكل 3A) وجعل بعناية أخرى تمزق صغير.
  8. في حين الضغط على الفم السنانير من الحيوان، وسحب بلطف بشرة أسفل في نهاية الخلفي من الحيوان (كما لو تقشير مرة أخرى).
  9. كما يتم سحبها بشرة الظهر، والدماغ، والدهون في الجسم، وأقراص تخيلي، والغدد اللعابية، ومقدم المعدة تصبح عرضة للخطر. إهاب منفصلة الآن في نهاية الخلفي ولكن لا تزال لديها سفينة الظهرية مع الغدة الليمفاوية المرتبطة به.
  10. قطع مقدم المعدة ونقله بعيدا عن منطقة الغدة الليمفاوية. والغدة الليمفاوية تحت المخ يكون على الرغم من أنك قد لا تكون قادرا على رؤية ذلك.
  11. ندف بعناية بعيدا الدهون في الجسم، الأمعاء، الغدد اللعابية، وغيرها من الهياكل التي قد تكون جالسا على الغدة. يجب الحرص على عدم فصل الغدة الليمفاوية من الغدة حلقة السفينة والظهرية الخلفية تقع إلى الدماغ. وسيتم وضع الغدة الليمفاوية شقة ضد المجهر الشريحة.
  12. إزالة جميع الأنسجة بعناية إضافية بعيدا عن الغدة الليمفاوية حتى الغدة بأكملها تتكشف من الفص الأمامي لمجموعة من الخلايا النهائي التامور.

ملاحظة: A الغدة الليمفاوية تشريح بشكل صحيح سوف يكون زوج واحد من الفصوص الأمامية ومجموعتين من الفصوص الخلفية الظهرية على طول السفينة (الشكل 6B). يمكن أن تتلف بسهولة الفصوص أو يمكن أن تقع الخروج من السفينة الظهرية. ولذلك ينبغي أن تعالج العينات بعناية كبيرة. الغدة أيضا حمع اتجاه الى تذبل أو العقد. استقامة بلطف من الجهاز في نهايته الخلفية يسمح لتقديمها جميع أجزاء وخلايا أيضا. وهذا أمر ضروري وخاصة بالنسبة للبروتوكولات المناعية.

فاي الجسم تشريح

  1. على المسرح المجهر تشريح لتشريح زايس 1000 (يمكن استخدام أي تشريح ستيريو المجهر)، ضع مربع الضوء الذي يسمح أن ينتقل الضوء الساقط من خلال العينة. وضع يرقة الطور الثالث من الخطوة 2 على شريحة المجهر في 200 ميكرولتر من 1X PBS. إمالة مصدر الضوء بعيدا عن العينة بحيث يظهر الكائن الحي شفافة، وبالتالي فمن السهل أن تصور أجهزتها الداخلية.
  2. باستخدام ملقط، ضع الحيوان بحيث نهاية الأمامي هو بعيدا عنك.
  3. باستخدام ملقط، من الاستمرار على بشرة اليرقة على الجانب الأيسر من فمه السنانير (رأس السهم 1، الشكل 3B). باستخدام ملقط أخرى، المسيل للدموع بلطف إهاب على طول الطريق حتى النهاية الخلفية (عrowhead 2، الشكل 3B). لا المسيل للدموع بشرة بعيدا عن الجسم في نهاية الخلفي.
  4. بدء إزالة بلطف جدا الأمعاء إلى جانب واحد.
  5. إزالة بلطف الدماغ، وأقراص تخيلي، والغدة الحلبة مع الغدة الليمفاوية من خلال تشغيل السفينة الظهرية.
  6. لا تقم بإزالة الغدد اللعابية لأنه ليس هناك الدهون في الجسم التمسك هذه الغدد.
  7. إزالة بلطف إهاب وترك الدهون في الجسم على الشريحة في برنامج تلفزيوني 1X.

ملاحظة 1: الدهون في الجسم واحد فقط طبقة الخلايا ولذلك فمن المهم أن يكون كل الخلايا بالارض في نفس الطائرة على شريحة زجاجية. الخلايا عديد الصيغ الصبغية الداخلية وسهلة لتصور. وينبغي أن يكون عينة الجسم جيدا تشريح الدهون الطبيعية للخلايا الحفاظ على الاتصالات، وينبغي أن يكون الحد الأدنى من الدهون الكريات حول تشريح عينة (الشكل 6I، J).

ملاحظة 2: إذا البيض دبور لا تزال تتأثر النظام المضيف المناعي، وسوف initiatنشرة التنمية على الفور تقريبا. مراحل النمو المبكر للطفيل (من يرقة المضيف) يمكن الوصول إليها بسهولة من hemocoel تشريح (الشكل 8). البيض أو اليرقات الطفيلية الالتزام إما إلى الدهون في الجسم أو غيرها من الأجهزة، أو ببساطة الانزلاق على الشريحة الزجاجية أثناء تشريح.

4. تحليل الأنسجة المناعي

  1. الغدد الليمفاوية الهواء الجاف ل5-10 دقيقة PBS 1X وإزالة الشريحة من الدهون في الجسم قبل تحديد لمدة 5-10 دقائق مع بارافورمالدهيد 4٪ يحضر في برنامج تلفزيوني. يمكن لكل شريحة لديها العديد من الغدد الليمفاوية تشريح لتلطيخ. نقل الشرائح مع عينات ثابتة في غرفة ومرطب محلية الصنع لخطوات لاحقة. ويتم إعداد هذه القاعة من خلال وضع قطعتين من مطوية، مناشف ورقية مبللة في الجزء السفلي من مربع البلاستيكية الفارغة تلميح micropipette. يمكن وضع واحد أو أكثر الشرائح مع عينات على رأس المفرق تستخدم لعقد نصائح.
  2. على هذا النحو، ويتم تحليل الأنسجة المناعية بعد أن الطرق القياسيةالجمع بين الخلية الحية في وضع العلامات وغير المباشرة 4 المناعية.

5. ممثل النتائج

  1. عدوى دبور ينشط التعبير عن الرقم مراسل مسار Drosomycin-GFP (الشكل 6G، J). في هذه التجربة، وتأثير الإصابة على دبور، التعبير الجيني هو تصور في الجسم الحي باستخدام GFP-مراسل مرتبطة المروج الدكاترة 12. في الحيوانات غير المصابة السيطرة، لم يتم الكشف عن التعبير GFP. تم الكشف بوضوح الإشارة GFP في السيتوبلازم والنواة من خلايا الجسم الدهون، تشريح الحيوانات المصابة من L. victoriae. للحصول على أفضل النتائج، فإن نسبة الدبابير: يجب أن يكون المضيفين 1:10. وينبغي للعدوى تستمر لمدة لا تقل عن 2 ساعة. الإصابة آخر، واشتداد إشارة DRS-GFP والعديد من خلايا الجسم الدهون هي GFP إيجابية حتى تصل إلى 1،4 72 ساعة.
  2. عدوى دبور يدفع تمايز lamellocytes في لالغدة ymph (الشكل 6D). Lamellocytes محاصرته ومنع التنمية دبور (الشكل 6H). وتشريح الغدد الليمفاوية لتصور التغيرات الخلوية التي يسببها في الفص الأمامي بعد L. victoriae العدوى. حديثا متباينة lamellocytes موجودة في محيط الفص تشريح؛ يتم وضع علامة lamellocytes مع التحوير GFP التي يقودها محسن ممسوخ (GFP-MSNF9). جميع الخلايا الخيطية تصور مع الأكتين باستخدام رودامين التي تحمل علامات phalloidin. لاحظ أنه يتم تعطيل سلامة الفصوص الأمامية في هذه الغدد والغشاء القاعدي الذي يحيط عادة الفص باستمرار (الشكل 6C)، هو الآن متقطع (الشكل 6D). من تشريح نفسه، يمكن lamellocytes في الدملمف أيضا تصور في مسحات (الشكل 6G)؛ ترتبط بعضها مع هيكل الكبسولة شكلت لمنع الطفيليات التنمية (الشكل 6H).
  3. Sوأعرب عن pätzle البروتين في معظم خلايا من الغدة الليمفاوية اليرقات (الشكل 7C، D). للكشف عن SPZ في تشريح الغدد الليمفاوية، تابعنا بروتوكول قياسي لتلطيخ الخلايا في غدة الليمفاوية مع الأجسام المضادة المقاومة للSPZ بولكلونل 4. في الجسم الحي، الزيادة في مستويات SPZ الخلايا الليمفاوية بعد الإصابة الغدة دبور (قارن لوحات الشكل 7C، E مع 7G، I، و7D ألواح F مع 7H، J).
  4. المبكرة والمتأخرة مراحل التنمية من اليرقات دبور المضيفة والشرانق (الشكل 8). لدراسة مراحل نمو الدبابير، وتشريح اليرقات المصابة في نقاط زمنية مختلفة بعد وضع البيض. هنا نعرض عينات من هذه المراحل من النيابة Leptopilina. من نوع البرية المصابة D. يستضيف الدروسوفيلا.

الشكل 1الشكل 1. تم الحصول على الأنواع المختلفة ووضع البيض دبور من البيض دبور. جميع الصور باستخدام stereomicroscope لايكا. A دبور drosophilae Trichopria الإناث البيض في oviposits D. الدروسوفيلا التكبير B خادرة. من وضع البيض من drosophilae Trichopria إلى خادرة البقع المضيف C. Melanized تشير التئام الجروح في موقع وضع البيض. L. D boulardi الذكور. G. E xanthopoda الإناث. L. F victoriae الإناث. G L. heterotoma ذكر (يسار) والإناث.

الشكل 2
الشكل 2. دورات الحياة تظهر سباق التسلح الطيران / دبور. نتائج وضع البيض في واحدة من نتيجتين. ردود فعل المضيف المناعي إما تنجح لمنع تطور دبور (اليسار)، أو دبور ويحبط RESPO المضيف المناعيnses وينجح (يمين). تعديل من Melk، وجوفيند، 1999 18.

الشكل 3
الشكل 3. تم الحصول على يرقات الطور الثالث تظهر أجهزة الفائدة قبل تشريح. جميع الصور باستخدام stereomicroscope لايكا. يرقة HML GFP> مع GFP (الخضراء) مضان (السهم) في الخلايا الفردية للغدة الليمفاوية يشير إلى الموقع العام للغدة الليمفاوية في حيوان سليمة. تم تصوير اليرقة مع عدسات مجال مضان ومشرقة. رؤوس سهام تشير إلى مواقع هامة للتشريح الغدة الليمفاوية بروتوكول الموصوفة في النص. B أعمال المؤتمر يرقة GFP> مع التعبير GFP في الدهون في الجسم للإشارة إلى موقع الجهاز في أنيم سليمةآل. رؤوس سهام تشير إلى مواقع مهمة لبروتوكول تشريح الجسم الدهون هو موضح في النص.

الشكل 4
الشكل 4. وتظهر المناعة الوراثية الدوائر استجابة المضيف المناعية ضد الطفيل المكونات الاساسية الهجوم. لمسار الرقم. يتم تنشيط Spätzle (SPZ) بواسطة انزيم البروتيز تجهيز Spätzle، SPE. المنشط SPZ بمثابة يجند للتول. إشارات بين الخلايا يؤدي إلى تفعيل عوامل النسخ NF-كيلوبايت، الظهرية وضيف. الصبار بمثابة مثبط لمسار IκB. يمكن رصدها تفعيل Drosomycin، طريقا الرقم الكنسي الجينات المستهدفة، وذلك باستخدام سلالات ذبابة جينيا مع مراسل GFP (انظر الشكل 6I، J).

الشكل 5
الشكل 5. التغليف ردا على L. الإصابة في victoriaeوأعرب عن الثعبان> GFP-DL المضيفين ذبابة الفاكهة. محسن في الجين في خلايا الدم الثعبان 13. عندما يدفع هذا محسن تعبير عن انصهار بروتين GFP-الظهرية في التحوير، يتم الكشف عن طريق مضان الظهرية الخضراء GFP في بعض plasmatocytes وlamellocytes التي تشكل كبسولات والمجاميع. تم الحصول على جميع الصور باستخدام مجهر زايس LSM مبائر. بيضة من L. تكبير victoriae. Lamellocytes BD (الأسهم البيضاء) في نهاية الخلفي من البيض صريحة GFP-الظهرية. CD العالي من العينة B. في لوحة EH يتم counterstained عينات مع رودامين التي تحمل علامات phalloidin لتصور أكتين الخيطية (F-الأكتين والأحمر) ومع هويشت 33258 لتصور الحمض النووي (الأزرق). E البيض مغلف من L. victoriae كبسولة F. Melanized من L. victoriae. GH L. victoriae infection يدفع خلايا الدم (plasmatocyte وlamellocyte) التجميع.

الشكل 6
الشكل 6. الاستجابات المناعية ضد العدوى دبور. الصور في لوحات تم الحصول على ألف وباء باستخدام نطاق محوري زايس. الصور في لوحات تم الحصول عليها باستخدام مجهر CJ LSM زايس مبائر. يرقة المضيف تظهر melanized البيض دبور مغلف (رأس السهم) من خلال بشرة شفافة. B ممثل ثالث الليمفاوية الطور اليرقي الغدة ملطخة هويشت 33258 يكشف خلايا جميع فصوص وخلايا التامور يتخلل. شريط النطاق يمثل 100 μ. CJ كانت counterstained جميع العينات مع هويشت 33258 (نوى لتسمية) ورودامين phalloidin (لتسمية F-أكتين). CD الغدة الليمفاوية فصوص الأمامي من التحكم (C) وL. victoriae المصابين (D) MSNF9-GFP الحيوانات. في الحيوانات المصابة، MSNF التعبير محسن، محددة الى لوس انجليستم الكشف عن mellocytes 14، مع مراسل GFP النووية. Plasmatocytes E معزولة عن الحيوانات غير المصابة لا تعبر عن GFP. هذه الحيوانات لديها عدد قليل جدا إن وجدت lamellocytes. Plasmatocytes F (GFP سلبية، سهم القصير) وحديثا متباينة، وأكبر lamellocytes (الأسهم طويلة) مع ضعف التعبير GFP النووية من L. victoriae المصابين MSNF9-GFP اليرقة. plasmatocytes G الحرة والمجمعة وlamellocytes من hemocoel من L. victoriae المصابين DRS-GFP اليرقة. يتم تنشيط التعبير لمراسل DRS-GFP في بعض plasmatocytes (السهم قصيرة)، ولكن ليس في lamellocytes (الأسهم طويلة) بعد العدوى. مغلف H دبور وmelanized يرقة من L. boulardi المصابة MSNF9-GFP يرقة المضيف. العديد من MSNF9-GFP إيجابية lamelloctyes تحيط اليرقة دبور (هيكل الظلام؛ سهم سميكة) ويحمل قوية التعبير GFP النووية (الأسهم طويلة). هذا عمومش نشرت سابقا في بلوس وان 15. خلايا الدهون في الجسم تشريح IJ من غير مصاب (I) وL. victoriae المصابين (J) DRS-GFP اليرقة. GFP هو النووي وحشوية في خلايا الجسم من الدهون من الحيوانات المصابة. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 7
الشكل 7. كانت counterstained التعبير Spätzle بعد الإصابة دبور الطفيل. عينات AJ مع هويشت 33258 لتصور DNA. تم الحصول على جميع الصور باستخدام مجهر زايس LSM مبائر. فصوص AF الأمامي من اليرقات تشريح YW غير مصاب. تم تجهيز العينات للالمناعية غير المباشرة دون الأجسام المضادة الأولية (A و B) أو مع الأجسام المضادة لمكافحة SPZ (الأحمر؛ C، D، E، F) وcounterstained مع اليكسا طحين-phalloidin لتسمية F-الأكتين في الخلايا (الأخضر؛. B، D، F) فصوص GJ الأمامي من تشريح اليرقات المصابة وYW الملون مع الأجسام المضادة لمكافحة SPZ (الأحمر؛ G، H، I، J) واليكسا فلور-phalloidin (الأخضر؛ وحات H، J) EF العالي تكبير من العينات في C و D، على التوالي. IJ العالي تكبير العينات في G و H، على التوالي. على نطاق والحانات في لوحات AD، G، H تمثل 50 ميكرومتر.

الشكل 8
الشكل 8. اليرقات والعذارى مراحل L. heterotoma وL. تم عزل boulardi. مراحل فردية من اليرقات أو العذارى الإصابة ذبابة آخر المضيفين، كما هو محدد. تم الحصول على جميع الصور باستخدام نطاق محوري زايس. الصف الأعلى AF L. مراحل heterotoma و 1-6 أيام بعد الإصابة الصف السفلي. AF تال للمرحلة الجنينية L. مراحل boulardi، من 4 إلى 12 يوما بعد الإصابة.

figure-protocol-9 الشكل 9. الرسم البياني للبروتوكول التجريبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الاهتمام الدبابير الطفيلية من ذبابة الفاكهة هو ارتفاع والتقنيات الجزيئية لفك الجينوم كله تصبح أكثر كفاءة وفعالية من حيث التكلفة. ومع ذلك، بالنسبة لمضيفيهم مدروسة بشكل استثنائي، والجوانب الرائعة العديد من الأحياء دبور لا تزال غامضة. وتشمل هذه القضايا المتعلقة لاستضافة مجموعة، وكبت المناعة، تطفل إضافي، والسلوك. كان محور هذا العرض لإظهار آثار العدوى على أنسجة الذبابة المناعي. يمكن استخدام تقنيات أثبتت تشريح هنا لتحليل التعبير الجيني على مستوى الحمض النووي الريبي (في المو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

ونحن ممتنون للبروفيسور تود Schlenke لdrosophilae Trichopria، البروفيسور توني الملكية الفكرية لسلالات ذبابة المعدلة وراثيا، والأستاذ كارل هاشيموتو لمكافحة Spätzle الأجسام المضادة. نشكر أعضاء الحاضر والماضي من مختبر لمساهماتها في هذا العرض. وأيد هذا العمل من قبل المنح التالية: من المعاهد الوطنية للصحة (S06 GM08168، RISE 41399-009، وG12-RR03060)، وزارة الزراعة (NRI / USDA CSREES 2006-03817 و2009-35302-05277) وجامعة مدينة نيويورك PSC.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

جينيسي العلمية
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المواد نوع شركة كتالوج رقم
مواد لصيانة الثقافة الحشرات
خميرة النشطة الجافة فيشر العلمية S802453
يطير الغذاء وجبة الذرة والسكر معيار صفة
عسل نفل ذهب هولندي
قارورة البولي بروبلين قذيفة قارورة (الضيقة) فيشر العلمية AS514
إغلاق القارورة القطن المكونات فيشر العلمية AS212
إغلاق القارورة الطنانة المكونات AS273
المبردة الحاضنة الدقة 815 الحرارية العلمية 3721
المواد اللازمة لإعداد العينات
CO 2 خزان الصف الجافة العظام TW سميث UN1013
ملعقة الصيدلي ملعقة الدقيقة (14 سم) فيشر العلمية 21-401-15
لوحات بقعة اختبار بيركس 9-تشريح لوحة جيدا 85 مم X 100 مم توماس العلمية 7812G17
باستور الماصات الصودا الجير J & H بيرج 71-5200-05
ملقط الجراح أسلوب # 5 سيجما T-4662
الإيثانول 190 إثبات USP فيشر العلمية 04-355-221
الفورمالديهايد 37٪ ث / ث فيشر العلمية F79-1
الأجسام المضادة الثانوية Cy3 AffiniPure حمار المضادة للأرنب مفتش (H + L) 1:50 الإثارة 546 نانومتر؛ الانبعاثات 565 نيوتن متر جاكسون المناعي بحوث المختبرات، وشركة 711-165-152
Antifade (N-بروبيل غاللاتي) 4 ميكروغرام / مل في الجلسرين 50٪ في برنامج تلفزيوني 1X النائب Biomedicals 10274790
الغليسيرول فيشر العلمية G33-1
هويشت 33258 0،2 ميكروغرام / مل 352 نانومتر الإثارة؛ الانبعاثات نانومتر 461 الجزيئية مجسات H-1398
رودامين phalloidin 200 وحدة / مل (6.6ميكرومتر) 540 نيوتن متر الإثارة؛ الانبعاثات 565 نيوتن متر الجزيئية مجسات R415
الكسا فلور 488 phalloidin 300 وحدة / مل 495 نانومتر الإثارة؛ الانبعاثات نانومتر 518 الجزيئية مجسات A12379
المستهلكات
غسل الزجاجة Fisherbrand فيشر العلمية 03-409-22A
Kimwipes كيمبرلي كلارك فيشر العلمية 06-666A
ورقة منشفة 1 رقائق C-طية ريشة 7CFTB2400-901
المجهر ونبسب؛
لايكا stereomicroscope MZFLIII إمبراطورية التصوير أنظمة، وشركة 10446208
زايس Stereomicroscope STEMI 1000 أو 2000 C- كارل زايس 000000-1006-126
ضوء المصدر - LED معقوفة الضوء فيشر العلمية 12563501
مرحلة ضوء مربع تنتقل مع لوحة كارل زايس 455137000
زايس ليزر متحد البؤر المسح الضوئي المجهر LSM 510 كارل زايس
زايس المجهر المركب Axioplan 2 تستقيم كارل زايس
دبور سلالات يطير سلالةق
Leptopilina victoriae 16 YW
Leptopilina boulardi 17 1 UAS GFP-17-الظهرية
Leptopilina heterotoma 2 SerpentHemoGal4 13
Leptopilina heterotoma 14 1 MSNF9-14 moCherry
Trichopria drosophilae MSNF-15 GFP
Ganaspis xanthopoda 18 YW الثعبان-Gal4 UAS GFP-Dorsal/Basc 4
YW؛ Drosomycin-GFP/CyO Y + 12

المراجع

  1. Schlenke, T. A., Morales, J., Govind, S., Clark, A. G. Contrasting infection strategies in generalist and specialist wasp parasitoids of Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3, 1486-1501 (2007).
  2. Chiu, H., Morales, J., Govind, S. Identification and immuno-electron microscopy localization of p40, a protein component of immunosuppressive virus-like particles from Leptopilina heterotoma, a virulent parasitoid wasp of Drosophila. J. Gen. Virol. 87, 461-470 (2006).
  3. Gueguen, G., Rajwani, R., Paddibhatla, I., Morales, J., Govind, S. VLPs of Leptopilina boulardi share biogenesis and overall stellate morphology with VLPs of the heterotoma clade. Virus Res. 160, 159-165 (2011).
  4. Paddibhatla, I., Lee, M. J., Kalamarz, M. E., Ferrarese, R., Govind, S. Role for sumoylation in systemic inflammation and immune homeostasis in Drosophila larvae. PLoS Pathog. 6, e1001234(2010).
  5. Sorrentino, R. P., Carton, Y., Govind, S. Cellular immune response to parasite infection in the Drosophila lymph gland is developmentally regulated. Dev. Biol. , 243-265 (2002).
  6. Sorrentino, R. P., Melk, J. P., Govind, S. Genetic analysis of contributions of dorsal group and JAK-Stat92E pathway genes to larval hemocyte concentration and the egg encapsulation response in Drosophila. Genetics. 166, 1343-1356 (2004).
  7. Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132, 2521-2533 (2005).
  8. Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int. J. Dev. Biol. 54, 1117-1125 (2010).
  9. Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21, 3044-3060 (2007).
  10. Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu. Rev. Immunol. 25, 697-743 (2007).
  11. Schlegel, A., Stainier, D. Y. Lessons from "lower" organisms: what worms, flies, and zebrafish can teach us about human energy metabolism. PLoS Genet. 3, e199(2007).
  12. Ferrandon, D., Jung, A. C., Criqui, M., Lemaitre, B., Uttenweiler-Joseph, S., Michaut, L., Reichhart, J., Hoffmann, J. A. A drosomycin-GFP reporter transgene reveals a local immune response in Drosophila that is not dependent on the Toll pathway. EMBO J. 17, 1217-1227 (1998).
  13. Bruckner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C. M., Rorth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev. Cell. 7, 73-84 (2004).
  14. Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila. Genesis. 47, 771-774 (2009).
  15. Tokusumi, T., Sorrentino, R. P., Russell, M., Ferrarese, R., Govind, S., Schulz, R. A. Characterization of a lamellocyte transcriptional enhancer located within the misshapen gene of Drosophila melanogaster. PLoS One. 4, e6429(2009).
  16. Morales, J., Chiu, H., Oo, T., Plaza, R., Hoskins, S., Govind, S. Biogenesis, structure, and immune-suppressive effects of virus-like particles of a Drosophila parasitoid, Leptopilina victoriae. J. Insect Physiol. 51, 181-195 (2005).
  17. Bettencourt, R., Asha, H., Dearolf, C., Ip, Y. T. Hemolymph-dependent and -independent responses in Drosophila immune tissue. J. Cell Biochem. 92, 849-863 (2004).
  18. Melk, J. P., Govind, S. Developmental analysis of Ganaspis xanthopoda, a larval parasitoid of Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 202, 1885-1896 (1999).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

مضيفات ذبابة الفاكهةتشريح الغدة اللمفاويةعزل الجسم الدهنيالحفاظ على مستنبتات الدبورتحليل الأنسجة المناعيةاستخلاص الدم اللمفاويتقنية تقشير القشيرةالمجهر الفلوريتحليل التعبير الجيني
مقدمة لالدبابير الطفيلية من
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.